净水处理剂-微生物絮凝剂（二）

2.3操作过程

以野生菌谷氨酸棒杆菌为出发菌株，该菌能够以葡萄糖或鹿糖为碳源合成一种以半乳糖醛酸为主要结构单元的新型生物絮凝剂。进行紫外和甲基磺酸乙酯逐级诱变，获得一株絮凝剂高产菌，获得突变株，合成生物絮凝剂的最佳发酵条件：葡萄糖为碳源，尿素和酵母膏为氟源，培养基初始pH为4~8,种子最佳种龄16h,接种量5%,发酵催通风量1U,搅拌转速100rpm。在此发酵条件下，絮凝活性最高可达到892U/mL。

为提高该菌株合成产量，采用传统的物理化学诱变方法来对原有的絮凝剂产生菌株进行改造，以期从根本上提高菌株合成絮凝剂的能力，获得絮凝剂高产变异株。

高效微生物的应用是有机难降解废水实现高效处理的关键所在。国内外研究者已经筛选得到一些难降解有机物的高效降解菌。目前国内外研究较多的还有白腐真菌。与细菌相比，白腐真菌具有降解底物非专一性，对多种结构各异的有机污染物具有独特的降解能力以及无需特定污染物的预条件化等优势。白腐真菌产生的细胞外酶-木质素过氧化酶和猛过氧化物酶被认为是降解木质素和染料的恃殊酶系，其中研究最多的是黄孢原毛平革菌。

微生物絮凝剂絮凝活性高，而且作用条件粗放，因此可以广泛应用于污水和工业废水处理中。寻找高效微生物絮凝剂产生菌、提高絮凝活性、降低絮凝剂用量、低生物絮凝剂的生产成本是微生物絮凝剂能否在工业上推广的关键所在。目前能降解石油的微生物多达200多种，由于微生物的数量和品种的广泛使得人们能够找到降解某种有机物的专一菌种，这无疑给难降解有机物的去除带来巨大潜力和希望。

目前微生物絮凝剂的主要处理对象有活性运泥、粉煤灰、泥浆水、高岭土、粪尿水、印染废水、淀粉废水等。

从发展势态来看，微生物絮凝剂的高效特性将会成为水处理剂中的发展热门。天然的生物絮凝剂（MBF)是一类由微生物产生的可使液体中不易降解的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体等凝集、沉淀的特殊高分子代谢产物。该类絮凝剂是利用生物技术，通过微生物发酵、分离提取而得到的一种新型、高效、廉价的水处理剂。

产生MBF的微生物主要有霉菌、细菌、放线菌和酵母，主要用于混凝和脱色。MBF的制备目前集中在筛选菌种和培养基配方的研究，并取得很多进展，但同时存在成本高、菌种遗传稳定性不够、絮凝效果单一的问题，致使其难以投入实际应用。

例1

①蛋白胨乳酸钠培养基（g/L):蛋白胨20g、酵母膏（牛肉膏10g、乳酸钠4g、KH2PO40.5g、NH4C11g、N2S041g、七水硫酸镁2g、L斗胱氨酸0.6g,蒸馏水稀释至1000mL混匀，用20%NaOH溶液调节pH为7.2。用灭菌锅在12°C保温25min后，冷却备用。

②改良培养基（g/L):酵母膏10g、葡萄糖20g、NaC5g、NH4C11g、KH2PO42g,蒸馏水稀释至1000mL混匀，用20%NaOH溶液调节pH为7.2。用灭菌锅在121°C保温25min后，冷却备用。

③巯基乙酸盐培养基（g/L):胰化胨17.5g、大豆蛋白胨2.5g、葡萄糖10g、NaC5g、KH2PO42g、疏基乙酸钠1g、琼脂0.8g,蒸馏水稀释至1000mL混匀，用20%NaOH溶液调节pH值为7.2。用灭菌锅在121°C保温25min后，冷却备用。

首先，培养基的筛选。将三个菌种中的每一个菌种都接种到三种不同培养基中，在每种培养基中以硫酸择形式分别加入锌离子，浓度为50mg/L。

例2

以牛肉膏蛋白胨为细菌分离培养基，筛选用培养基（g/L):NaN0323g,KC0.9g,K2HP041g,MgS040.5g,FeS040.01g,蔗糖30g和蒸溜水1L,pH自然，121°C灭菌20min。

将分离到的单个菌株接种于筛选培养基中，各菌株于30°C、摇床转速160rpm条件下培养60~72h,以2mL培养液对100mL0.4g/mL高岭土悬浮液是否絮凝进行初筛。定量测定发酵液的絮凝活性，进行复筛。

例3

采用CorynebacteriumgtutamicumCC~CCM201005菌种，培养基如下：

斜面培养基（g/L):葡萄糖5,酵母膏1,牛肉膏1g,胰蛋白胨2g,硫酸亚铁微量，琼脂15〜20g。

种子培养基（g/L):葡萄糖10g,酵母膏0.5g,磷酸二氢钾0.1g,尿素0.5g,氯化钠0.1g,七水硫酸镁0.2g。

发酵培养基（g/L):碳源10g,氮源1g,礎酸二氢钾0.1g,氯化钠0.1g,硫麟0.1g。

筛选培养基（g/L):邻苯二甲酸二丁酯10(mL),酵母膏0.5g,磷酸二氢钾0.1g,尿素0.5g,氯化钠0.1g,七水硫酸镁0.1g。

以上培养基pH值均为8.0。

培养方法如下：

①种子培养：于新鲜斜面取一环菌，接入种子培养基（100mL/250mL三角瓶），28°C,120rpm振荡培养16h。

②摇瓶培养：将培养16h的种子液以5%的接种量接入发酵培养基（100mL/250mL三角瓶），28°C,120rpm振荡培养48h。

③小罐分批培养：以5%(V/V)的接种量将种子培养液接入装有2L发酵液的3L发酵罐中，通气量为1U,搅拌转速100rpm,28°C,溶氧在线自动检测。

④紫外诱变方法：于新鲜斜面取一环菌接入种子培养基），28°C、120rpm培养16h,离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涂菌体三次，制成菌体浓度约为107个/mL的单细胞菌悬液，将此单细胞菌悬液于紫外灯下照射60s后，按5%的接种量接至发酵培养基中，28°C、120rpm暗室培养过夜，按稀释法涂布于筛选平板上，28°C恒温培养至菌落生长良好，菌落进行筛选。

为了获得更高的突变率，进一步提高絮凝剂产量，在紫外诱变的基础上，对菌株继续利用化学诱变剂进行策二次诱变。经过二次诱变后，尽管某些菌株的絮凝剂合成能力不是非常稳定，但总体而言，菌株合成絮凝剂的能力均得到显著提高。

例4

所用培养基：牛肉膏蛋白胨固体：牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaC5g。琼脂15~20g,H2O1L,pH为7.2~8.0。

查氏培养基：蔗糖30g,NaN033g,K2HPO41g,FeS040.01g,KC0.5g,MgS04.7H2O0.5g,H0O1L。

通用发酵培养基：葡萄糖20g,(NH4)2S040.2g,脲0.5g,KH2PO42g,K2HPO45g,NaCO.1g,酵母膏0.5g,H2O1L;

一号培养基：可溶性淀粉20g,KN033g,K2HP040.5g,Mg-S04.7H20O.5g,FeSCU0.01g,NaC0.5g,H2O1L。

筛选方法：将菌种稀释接种于固体琼脂平板单菌种接种于相应的平板，待充分生长后接种于发酵培养液中进行浅层发酵，控制条件为：水浴温度30°C,揺床转速为120rpm,pH为7左右，发酵时间72h。取发酵液测其絮凝活性，将具有良好的絮凝活性的菌株作为复筛菌种。

首先观察菌株在培养基中的生长状态，再通过巨大菌落观察和载片培养，进一步确定菌株的属种。

例5

高糖低氮培养基有利于絮凝剂的产生。适宜摇床发酵条件为：初始pH为7.5~8.5,培养温度30°C,摇床转速180rpm,发酵60h;在揺床优化的培养条件的基础上进行5L罐放大试验，发酵周期缩短12h,絮凝活性提高14.45%。

斜面培养基（％):

蛋白胨1.0;牛肉膏0.3;NaC0.5;琼脂1.5;pH为7.00。

发酵培养基（％):

葡萄糖1.0;果糖1.0;酵母膏0.05;脲0.05;(NH4)2S040.04;蛋白胨0.05;MgS040.02;KH2P040.5;NaC0.02;pH为8.0。

培养条件：

①摇瓶培养：从斜面转接种环菌，放于盛有30mL«酵培养基的250mL三角瓶中，回转式揺床30°C、180rpm培养60h。

②发酵罐培养：3.0ml发酵培养基装于5L发酵罐中，溶氧水平控制在30%,pH控制在8.0左右，30°C培养。

例6

菌株从旱田土壤中分离。

斜面培养基：牛肉膏10g/L,蛋白腺5g/L,NaC5g/L,琼脂15g/L,pH为7.2。

发酵培养基：蔗糖10g/L,牛肉膏6.6g/L,MgS04.7H2O0.2g/L,FeCI30.01g/L,pH为7.0。

121mL到80mL发酵培养基中，在30°C,150rpm条件下培养，间歇测定1ml培养基上清液对一定浓度高岭土悬浮液的絮凝活性。

该菌株所产絮凝剂的絮凝特性。在碱性条件下该絮凝剂对高岭土悬浮液具有良好的絮凝效果，且具有产生快、热稳定性强等特点，具有潜在的应用前景。

例7

产生絮凝剂的培养基：酵母法20g,KH2P041g,MgS04.7H20.5g,水1L,称之为YA培养基。在上述培养基的基础上改变初始pH值，碳氮源及其比例。

细菌鉴定所用培养基：伯克培养基（无氮培养用），硫化氢试验用培养基。

将菌源分别接种于牛肉膏蛋白陈培养基上，分别纯化多次。对分离纯化所得各菌株进行液体YA培养基与牛肉膏蛋白陈培养基发酵培养，培养振荡72h;分别测定培养液的絮凝活性。

例8

絮凝剂产生菌枯草杆菌：污泥和土壤样品经稀释后涂布于分离培养基中，37°C培养2天后检出高黏度、生长快的菌落。将分离得到的菌种接种到发酵培养基中，于旋转式摇床上（转速220rpm),37°C培养24h后检测发酵液的絮凝活性。挑取高效菌株用于下一步试验。

分离培养基：葡萄糖1%,酵母膏0.5%,谷氨酸钠0.5%,KH2PO4、0.05%；MgS04、0.01%,琼脂2%,pH值7.0。

基础培养基：酵母膏0.5%,KH2PO4、0.O5%；MgS04、0.01%,pH值7.0。

种子培养基：葡萄糖2%,酵母膏0.5%,K2HP04.3H2O0.2%,MgS040.025%,谷氧酸钠1%,pH值7.0。

发酵培养基：葡萄糖3%,酵母膏0.8%,K2HPCV3H2〇g.2%，MgS040.025%,谷氧酸钠1%,pH值为7.5。

培养条件：取1环菌体接种于种子培养基（500mL三角瓶装液量50mL),在转速220rpm,32°C条件下振荡培养15h,然后按1%接种量接种于发酵培养基培养。

产物的提取：离心去除发酵液所含细胞，上清液用3倍体积的乙醇进行沉淀，得黏性沉淀物，干燥得粗品，将粗品溶于蒸馏水后过夜透析，透析液经冷却等后处理得成品。

例9

将核桃壳，粉碎成粒径为0.5~2.0mm范围内的颗粒，经高温蒸煮并加入碱性药剂，进行脱脂处理，脱脂后的核桃壳碎粒进行清洗及搓洗脱皮处理，填充反应柱，填充密度为500g/L。

利用SDA(沙保罗琼脂培养基）从空气中分离到一株脱色真菌，为黑曲霉，在温度28~33°C,pH值为4~8脱色率最高。将在30°C用5DA平板纯培养5天后的菌种，用15mL无菌水洗下制成孢子悬液，按5%的接种量，将孢子悬液接种于装有40mL改进的马丁培养基的250mL摇瓶中，30°C下，150rpm振荡培养，培养数小时后，作为第一反面柱中固定化菌液。

反应器为两个串联的玻璃柱，将核桃壳颗粒填入反应柱，把已准备好的菌液分别对应接入装有模拟水样的1#柱和2#柱中静态培养挂膜。待水样色度上除后，进行通气培养，并添加少量生长培养基。每天换掉1/3上清液，待1#柱中核桃壳颗粒上生长出淡黄色生物膜。2#柱中核桃壳颗粒上生长出浅灰色生物膜后，以0.05L/h的小流量通水样，经动态培养，生物膜逐渐成熟，即可处理印染废水。用于处理废水，去水率94%,脱色率为99.4%。

例10

采用产气肠杆菌：培养基质量浓度（g/L):葡萄糖10.0,果糖10.0,酵母膏0.5,脲0.5,(NH4)2SO4、0.4,蛋白胨0.5,MgSO4、0.2,KH2PO4、5.0,NaC、0.2；0.1MPa下灭菌20min。

培养条件：将斜面菌种转接于盛有30mUg养基的250mL三角瓶中，在30°C,180rpm条件下揺床培养60h得培养液。

培养液离心去菌体，上清液4°C预冷后用1倍体积的丙酮沉淀，离心，沉淀用质量分数70%乙醇洗涤二次，真空干燥得到部分纯化的絮凝剂干粉。

将菌种稀释接种于固体琼脂平板，挑取单菌种接种于相应的平板，待充分生长后，接种于发酵培养液中进行浅层发酵实验，实验条件：水浴温度30°C,揺床转速为120rpm,pH值7左右，发酵时间72h。取发酵液测其絮凝活性，将具有良好的絮凝活性的菌种株作为复筛菌种。

经多次富集和划线分离，从活性污泥中筛选出霉菌，对高岭土悬液的絮凝力达97%。